وزارت علوم، تحقیقات و فناوری

پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست­ فناوری

پژوهشکده زیست­ فناوری پزشکی

 

پایان نامه کارشناسی ارشد

در رشته زیست­ شناسی سلولی- مولکولی

 

عنوان:

تاثیر کاهش حجم مایع بلاستوسل قبل از انجماد شیشه ­ای بر بیان ژن­های

اختصاصی اندودرم اولیه رویان موش

اساتید راهنما:

دکتر مجتبی دشتی­زاد

دکتر قاسم آهنگری

 

استاد مشاور:

دکتر مهدی شمس­آرا

 

اسفند ماه سال 1393

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

فهرست مطالب

1     مقدمه و مروری بر مطالعات انجام شده2

1-1     تکوین پیش از لانه­گزینی در موش3

1-1-1    لقاح

3

1-1-2     تکوین اولیه
5

1-1-3     مکانیسم­های مولکولی دخیل در لایه­زایی رویان
9

1-1-3-1     جدایی دو رده­ی سلولی تروفواکتودرم و توده سلولی داخلی

10

1-1-3-2     جدایی دو رده­ی سلولی اپی­بلاست و اندودرم اولیه
11

1-2     تکنیک­های کمک باروری13

1-2-1     لقاح آزمایشگاهی

13

1-2-1-1      کیفیت سلول تخم
14

1-2-2     کشت آزمایشگاهی رویان
15

1-2-3     انجماد
16

1-2-3-1     اصول انجماد
17

1-2-3-2     مواد سرما محافظ

18

1-2-3-3     روش­های انجماد
19

1-2-3-3-1     انجماد آهسته
20

1-2-3-3-2     انجماد شیشه ­ای

21

1-2-4     سوراخ کردن مصنوعی

22

2     مواد و روش­ها

.25

2-1     حیوان.25

2-2     تولید رویان آزمایشگاهی26

2-2-1     استحصال اسپرم
26

2-2-1-1     آماده ­سازی محیط و قطره­ها 26

2-2-1-2     جابجایی مهره­ی گردنی

27

2-2-1-3     تشریح موش نر و جداسازی اپیدیدیم
28

2-2-1-4     جمع­آوری و ظرفیت­پذیری اسپرم
29

2-2-2     استحصال تخمک

31

2-2-2-1     تحریک تخمک­گذاری

31

2-2-2-1-1      تزریق داخل صفاقی

31

2-2-2-2     آماده ­سازی محیط و قطره­ها 32

2-2-2-3     جابجایی مهره­ی گردنی

32

2-2-2-4     تشریح موش ماده و جداسازی لوله­ی تخم­بر
32

2-2-2-5     جداسازی توده­ی تخمک-کومولوس

33

2-2-3     لقاح آزمایشگاهی

34

2-2-3-1     آماده ­سازی محیط و قطره­ها 34

2-2-3-2     لقاح

35

2-2-4     کشت آزمایشگاهی

35

2-2-4-1     آماده ­سازی محیط و قطره­ها 35

2-2-4-2     کشت رویان
36

2-3     تولید رویان درون­تنی37

2-3-1     تحریک تخمک­گذاری و جفت اندازی موش­ها 37

2-3-2     آماده ­سازی محیط و قطره­ها 37

مطلب دیگر :
دانلود پایان نامه ارشد:بیوسیستماتیک مولکولی گونه های جنس Rindera از تیره Boraginaceae

2-3-3     جابجایی مهره­ی گردنی

37

2-3-4     تشریح موش ماده و جداسازی لوله­های رحمی

37

2-3-5     استحصال بلاستوسیست

38

2-4     سوراخ کردن مصنوعی بلاستوسیست39

2-4-1     آماده ­سازی محیط و قطره­ها 39

2-4-2     آماده ­سازی و تنظیم دستگاه ریز­دستکاری

40

2-4-3     روش کار
40

2-5     انجماد رویان41

2-5-1     انجماد شیشه ­ای

41

2-5-1-1     آماده ­سازی محیط و قطره­ها 41

2-5-1-2   روش کار
42

2-5-2        یخ­گشایی

43

2-5-2-1     آماده ­سازی محیط و قطرات

43

2-5-2-2   روش کار
44

2-6     بررسی بیان ژن.45

2-6-1     استخراج RNA از بلاستوسیست

45

2-6-2     ساخت cDNA

46

2-6-3      طراحی پرایمر
47

2-6-4     رقیق­سازی پرایمرها 47

2-6-5     واکنش زنجیرهای پلیمراز
48

2-6-6     ژل الکتروفورز محصولات PCR

49

2-6-7     واکنش زنجیرهای پلیمراز در زمان واقعی

49

2-7     طراحی آزمایش52

2-7-1     کاهش مایع بلاستوسل رویان­های درون­تنی موش، قبل از انجماد شیشه ­ای52

2-7-2     کاهش مایع بلاستوسل رویان­های برون­تنی موش، قبل از انجماد شیشه ­ای
.52

2-7-3     آنالیز آماری

52

3     نتایج.54

3-1     کاهش مایع بلاستوسل رویان­های درون­تنی موش قبل از انجماد  شیشه ­ای……………54

3-1-1     نرخ زنده­مانی و خروج از زونا 54

56

3-1-2-1     واکنش زنجیرهای پلیمراز
56

3-1-2-2     واکنش زنجیرهای پلیمراز در زمان واقعی

57

3-2      کاهش مایع بلاستوسل رویان­های برون­تنی موش قبل از انجماد  شیشه ­ای.62

3-2-1     نرخ زنده­مانی و خروج از زونا 62

64

4     بحث و نتیجه ­گیری67

5     فهرست منابع
.76

6     پیوست­ها83

فهرست جداول

جدول ‏1‑1: ترکیبات محیط HTF
14

جدول ‏1‑2: ترکیبات محیط KSOM

16

جدول ‏2‑1: محلول­های مورد نیاز برای انجماد شیشه ­ای بلاستوسیست موش

42

جدول ‏2‑2: محلول­های مورد نیاز برای یخ­گشایی بلاستوسیست موش

44

جدول ‏2‑3: مواد مورد استفاده جهت ساخت cDNA
46

جدول ‏2‑4: چرخه­های حرارتی ساخت cDNA
46

جدول ‏2‑5: مشخصات پرایمرهای طراحی شده 47

جدول ‏2‑6: مواد مورد نیاز جهت انجام واکنش زنجیره­ای پلیمراز 48

جدول ‏2‑7: چرخه­های حرارتی مراحلPCR 48

جدول ‏2‑8: مواد مورد نیاز جهت انجام Real Time PCR
50

جدول ‏2‑9: چرخه­های حرارتی Real Time PCR
50

جدول ‏3‑1: میزان زنده­مانی و میزان خروج از زونای بلاستوسیست درون­تنی موش

55

جدول ‏3‑2:  میزان زنده­مانی و میزان خروج از زونای بلاستوسیست برون­تنی موش
63

فهرست اشکال

شکل ‏1‑1: مراحل مختلف تکوین پیش از لانه­گزینی در موش

2

شکل ‏1‑2: بخش­های مختلف لوله­ی تخم­بر
3

مطلب دیگر :
پایان نامه ارشد:بررسی وجود و تعیین هویت فاکتورهای پاتوژنیسته در سویه های اشرشیا کلی یوروپاتوژن جدا شده از بیماران مراجعه کننده به بیمارستان بقیه الله (عج) تهران

شکل ‏1‑3: فرایند گامت­زایی
4

شکل ‏1‑4: اسپرم و تخمک PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)داران
5

شکل ‏1‑5: قطبیت رویان موش
6

شکل ‏1‑6: تقسیم مرحله­ی 8 به 16 سلولی
7

شکل ‏1‑7: تشکیل حفره­ی بلاستوسل
7

شکل ‏1‑8: آرایش سیستم­های انتقالی در سلول­های تروفواکتودرم 8

شکل ‏1‑9: بلاستوسیست در حال خروج از زونا 9

شکل ‏1‑10: مسیر تمایز رده تروفواکتودرم در موش
10

شکل ‏1‑11: جدایی دو رده سلولی اندودرم اولیه و اپی­بلاست در سه مرحله 11

شکل ‏1‑12: دخالت مسیر پیام­رسان FGF/MAPK 13

شکل ‏1‑13: فرایند شیشه ­ای شدن محیط انجماد
21

شکل ‏1‑14: روش­های مختلف سوراخ کردن مصنوعی حفره­ی بلاستوسل
24

شکل ‏2‑1: قفس­های دارای سیستم تهویه­ی مجزا 26

شکل ‏2‑2: پتری دیش استحصال اسپرم 27

شکل ‏2‑3: جابجایی مهره­های گردنی
28

شکل ‏2‑4: تشریح موش نر 29

شکل ‏2‑5: جمع­آوری اسپرم 30

شکل ‏2‑6: نحوه­ جمع­آوری اسپرم­های زنده از حاشیه­ی قطره­ی محیط کشت

30

شکل ‏2‑7: نحوه­ ترزیق داخل صفاقی موش

31

شکل ‏2‑8: پتری دیش استحصال تخمک

32

شکل ‏2‑9: جداسازی لوله­ی تخم­بر
33

شکل ‏2‑10: جداسازی توده­ی تخمک-کومولوس

34

شکل ‏2‑11: پتری دیش IVF
34

شکل ‏2‑12: تخمک-کومولوس­های مجزا 35

شکل ‏2‑13: نحوه­ قطره­گذاری محیط KSOM در پلیت کشت رویان
36

شکل ‏2‑14: جداسازی لوله­های رحمی
38

شکل ‏2‑15: استحصال بلاستوسیست از لوله­ی رحمی
39

شکل ‏2‑16: پتری دیش ریز دستکاری
40

شکل ‏2‑17: نحوه­ سوراخ کردن حفره­ی بلاستوسیست

41

شکل ‏2‑18: نحوه­ قطره­گذاری محلول­های انجماد شیشه ­ای
42

شکل ‏2‑19: موقعیت قرار گیری بلاستوسیست بر روی کرایوتاپ 43

شکل ‏2‑20: پتری دیش حاوی محلول یخ­گشایی
44

شکل ‏3‑1: بلاستوسیست­های درون­تنی موش بعد از انجماد-ذوب در محیط KSOM

56

شکل ‏3‑2: الکتروفورز محصولات PCR بر روی ژل آگارز
57

58

59

60

61

62

شکل ‏3‑8: مراحل مختلف رشد و تکوین رویان موش پیش از لانه­گزینی
63

64

65

چکیده فارسی

مطالعات انجام شده در سال­های اخیر نشان می­ دهند که سوراخ کردن مصنوعی بلاستوسیست قبل از انجماد شیشه ­ای، در بهبود کیفیت رویان­های ذوب شده موثر است
اما در این مطالعات، به نقش آب درون حفره و تاثیر آن بر روی تشکیل رده­های سلولی بلاستوسیست، توجه نشده است
بنابراین در تحقیق حاضر، علاوه بر ارزیابی نرخ زنده­مانی و خروج از زونا، اثر کاهش مایع بلاستوسل قبل از انجماد شیشه ­ای، بر روی میزان بیان ژن­های Gata6 و Grb2 در بلاستوسیست درون­تنی و برون­تنی منجمد-ذوب شده و سوراخ شده قبل از انجماد بررسی شد و با گروه کنترل مقایسه گردید
در این مطالعه، میزان خروج از زونا با سوراخ کردن مصنوعی بلاستوسیست قبل از انجماد، به­صورت     معنی­داری افزایش یافت
این در حالی است که میزان زنده­مانی در گروه­های تحت تیمار، مشابه با گروه کنترل، بالا بود
انجماد شیشه ­ای موجب افزایش در میزان بیان ژن­های Gata6 و Grb2 شد (p<0.05)
اما با کاهش مایع بلاستوسل قبل از انجماد، در بلاستوسیست­های درون­تنی، میزان بیان این ژن­ها نسبت به گروه انجماد شیشه ­ای به­صورت معنی­داری کاهش پیدا کرد و به گروه کنترل نزدیک شد (p<0.05)
در حالی که در مورد بلاستوسیست­های برون­تنی، با بهره گرفتن از این تکنیک، بیان ژن Grb2 افزایش پیدا کرد ولی تفاوت معنی­داری در میزان بیان ژن Gata6 نسبت به گروه انجماد شیشه ­ای ایجاد نشد
از   آن­جایی که هیچ نتیجه­ای مبنی بر تاثیر منفی استفاده از این تکنیک مشاهده نگردید و با توجه به افزایش میزان خروج از زونا، کاهش حجم مایع بلاستوسل قبل از انجماد شیشه ­ای می ­تواند مفید واقع شود

مطلب دیگر :
پایان نامه ارشد:جداسازی و شناسایی گونه های کاندیدا و ارزیابی حساسیت آنها به فلوکونازول (Fluconazole) در مبتلایان به فرم عود کننده ولوواژینیت کاندیدیایی ( RVVC ) شهرستان گناباد

کلمات کلیدی: لقاح آزمایشگاهی، انجماد شیشه ­ای، سوراخ کردن مصنوعی، بیان ژن، Real Time PCR

مقدمه و مروری بر مطالعات انجام شده

تکوین قبل از لانه­گزینی[1]، در همه­ی PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)داران با یک سلول منفرد به نام تخم[2] آغاز می­ شود و با ایجاد بلاستوسیست[3] از طریق چندین تقسیم متوالی، پایان می­یابد (Rossant and Tam, 2009)
مطالعه در مورد رخداد­های این دوره، برای افزایش موفقیت در تکنیک­های کمک باروری[4] الزامی است
بیشتر اطلاعات ما درباره تکوین قبل از لانه­گزینی، از مطالعه بر روی موش بدست آمده است
از مزایای استفاده از موش می­توان به تعداد نژادهای بسیار زیاد، تشابه ژنتیکی بالا با انسان، ارزان بودن گونه­ موش نسبت به سایر گونه­ ها، دوران بارداری کوتاه، تعداد زیاد نوزادان در هر دوره­ بارداری، سایز کوچک و نگهداری آسان اشاره کرد
بر همین اساس، استفاده از این مدل آزمایشگاهی در تحقیقات مربوط به فرایند­های تولیدمثلی و تکنیک­های کمک باروری رایج می­باشد

تعداد صفحه : 103

قیمت : 14700 تومان

بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود

پشتیبانی سایت :        *       asa
goharii@gmail
com

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید