رشته برق: دانلود پایان نامه ارشد درمورد مستندسازی، آزاد سازی-رشته برق

ط Miller و همکاران ارایه شده است. با توجه به شرایط آزمایشگاه و امکانات موجود، در این روش تغییراتی داده شد.

۳-۳-۱- بافرها و محلول‌های مورد استفاده در استخراجDNA
بافر جدا کننده: این بافر باعث شکسته شدن دیواره سلول‌های خونی و خروج هسته از درون سلول می‌شود. ترکیبات بافر جداکننده در جدول ۳-۲ آمده است.

جدول ۳-۲- مواد تشکیل دهنده بافر جدا کننده
غلظت مواد
مواد استفاده شده
۱۵ میلی مولار
۳۲/۰ مولار
۵ میلی مولار
۱ درصد
تریس HCl
ساکارز
کلرید منیزیم
تریتون ۱۰۰ درصد

بافر لیز کننده: از این بافر به منظور تجزیه سلولی دیواره هست و آزاد سازی محتویات آن استفاده شده است. ترکیبات تشکیل دهنده این بافر در جدول ۳-۳ آورده شد..

جدول ۳-۳- مواد تشکیل دهنده بافر لیز کننده
غلظت مواد
مواد استفاده شده
۱۵ میلی مولار
۴۰۰ میلی مولار
۲ میلی مولار
تریس HCl
کلرید سدیم
EDTA

بافرهای ذکر شده پس از تهیه، برای استریلیزه شدن به مدت ۱۵ دقیقه در دستگاه اتوکلاو در دمای ۱۱۵ درجهسانتی‌گراد با فشار یک اتمسفر قرار داده شدند.
محلول استات سدیم ۲/۳ مولار: این محلول سبب یونیزه شدن DNAمی‌شود، به طوری‌که تمایل DNA را برای حل شدن در محیط غیر آبی کاهش می‌دهد. این محلول باعث تغلیظ DNAمی‌شود.
SDS10 درصد: باعث حل شدن چربی‌های موجود در غشای سلول می‌شود. این محلول قابل اتوکلاو شدن نیست.
محلول کلرید سدیم ۶/۵ مولار: پس از استفاده از آنزیم پروتئیناز K از این محلول برای حذف آلودگی پروتئین استفاده می‌شود.
اتانــول ۷۰ درصد: از اتانول مطلق تهیه می‌شود که برای شستشوی DNA مورد استفـــاده قرار می‌گیرد. این محلول باعث حذف نمک باقی‌مانده از مراحل استخراج می‌شود.
کلروفرم: برای حذف پروتئین‌های باقی‌مانده استفاده می‌شود.
پس از تهیه محلول‌ها و بافرهای یاد شده، تمام وسایل مورد نیاز برای استخراج DNAاستریل شدند.

۳-۳-۲- مراحل استخراج DNA از نمونه‌های خون
– پس از یخ گشایی، مقدار ۵/۱ سی سی از خون کامل در داخل لوله‌های آزمایش استریل ریخته شد.
– دو برابر حجم خون، بافر جدا کننده اضافه و کاملاً ورتکس شد.
– محلول فوق به مدت ۶ دقیقه با سرعت ۶۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ شد.
– پس از سانتریفیوژ، مایع بالایی با خم کردن لوله تخلیه و رسوب حاصله نگهداری شد.
– از مرحله ۲ تا ۴ تا رسیدن به یک رسوب سفید و عاری از لکه‌های خونی، تکرار شد.
– هم حجم اولیه خون (۵/۱ میلی لیتر) از بافر لیز کننده به رسوب داخل لوله آزمایش اضافه و به خوبی ورتکس گردید، تا زمانی که رسوب تشکیل شده کاملاً باز شد.
– مقدار ۴ میـــکرولیتر از آنزیم پروتئیناز K و ۷۰ میکرولیتر از SDS 10 در صد به محـــلول فوق اضافه شده و چند ثانیه ورتکس شد.
– در این مرحله لوله‌های آزمایش به مدت سه ساعت در دمای ۵۵ درجه سانتی‌گراد یا به مدت ۱۲ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد در بن ماری تیمار شدند.
– پس از خروج لوله‌ها از بن ماری، مقدار ۱۷۰۰ میکرو لیتر کلرید سدیم ۶/۵ مولار به لوله‌های آزمایش اضافه شده، سپس به مدت ۱۵ ثانیه با دست به شدت تکان داده شد.
– لوله‌های آزماش به مدت ۲۰ دقیقه با سرعت ۳۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. در این زمان در لوله آزمایش دو لایه به وجود می‌آید، لایه بالایی دارای DNA است که به کمک سمپلر به درون لوله آزمایش دیگری انتقال داده شد.
– هم حجم مایعی که انتقال داده شده است، کلروفرم اضافه و به آرامی چند بار تکان داده شد و به مدت ۱۰ دقیقه با دور ۳۰۰۰ دور در دقیقه، سانتریفیوژ شد.
– در این مرحله دو فاز ایجاد می‌شود که فاز بالایی حاوی DNA است. با استفاده از سمپلر فاز بالایی برداشته شد و به لوله آزمایش دیگری انتقال داده شد. در این مرحله برای متراکم کردن DNA، به مقدار ۱/۰ حجم محلول، استات سدیم ۲/۳ مولار اضافه شد.
– دو برابر حجم محلول، اتانول مطلق کاملا سرد اضافه شد. اتانول مطلق برای آبگیری DNA و غلیظ‌تر شدن آن اضافه می‌شود. پس از اضافه کردن اتانول مطلق، لوله آزمایش به آرامی با دست تکان داده شد تا زمانی که کلاف DNA ظاهر شود.
۳-۳-۳- ذخیرهDNA

متن کامل در سایت    40y.ir

بعد از این‌که کلافDNAتشکیل شد با استفاده از لوله‌های شیشه‌ای استریل (پیپت پاستور) به دقت برداشته شده و به داخل تیوب‌های استریل با حجم ۵/۱ میلی لیتر انتقال داده شد. در داخل تیوب استریل با توجه به کلاف مورد نظر مقدار ۲۵۰-۱۵۰ میکرو لیتر از آب مقطر دو بار تقطیر دیونیزه برای حل شدن و نگهداری DNA ریخته شد. برای اینکه کلافDNA بهتر حل شود، تیوب استریل به مدت ۳۰-۱۵ دقیقه در دمای ۵۵ درجه سانتیگراد در بن ماری قرار داده شد. پس از اینکه DNA کاملاً در بافر حل شد، تیوپ‌های دارای DNA در دمای ۲۰- درجه سانتی‌گراد ذخیره شدند.

۳-۳-۴- تعیین ویژگی‌های کیفی DNA
برای تعیین کیفیت DNA استخراج شده از روش الکتروفورز ژل آگارز استفاده شد.

۳-۳-۴-۱- تعیین کمیت و کیفیتDNA به وسیله الکتروفورز ژل آگارز
در ابتدا محلول TBE(10X) با استفاده از مواد موجود درجدول ۳-۴ تهیه شده و در ظرفی دربسته درون یخچال نگهداری شد تا هنگام استفاده برای تهیه TBE(1X) مورد نیاز در تهیه ژل آگارز و تانک الکتروفورز رقیق سازی شود.

جدول ۴-۴- مواد محلول TBE(10X)
مواد مورد نیاز
مقدار مواد
تریس به یس
۱۰۸ گرم
بوریک اسید
۵۵ گرم
EDTA
۵/۷ گرم

برای تعیین کیفیت DNA استخراج شده از ژل آگارز ۷/۰ درصد استفاده شد. برای تهیه آگارز ۷/۰ درصد با توجه به حجمژل (طول ژل× عرض ژل× ضخامت ژل)، به مقدار لازم از پودر آگارز وزن‌کشی شده و با بافر TBE(1X) به حجم موردنظر رسانده شد. سپس تا رسیدن به دمای جوش حرارت داده شد، به شیوه‌ای که رنگ محلول کاملا شفاف شود. بعد از آن که محلول به اندازه کافی خنک شد و دمای آن به ۴۰ تا ۵۰ درجه سانتی‌گراد رسید، در سینی ژل که از پیش آماده شده بود، ریخته شد تا ژل کاملا ببندد. بعد از جدا کردن شانه و شکل گیری چاهک‌ها، سینی حاوی ژل در تانک الکتروفورز که آن نیز دارای بافر TBE(1X) بود قرار داده شد. برای بار کردن نمونه‌ها در داخل هر چاهک، ۲ میکرولیتر از DNA استخراج شده با ۱ میکرولیتر بافر بارگذاری مخلوط شده و داخل چاهک‌ها ریخته شد.
بافر بارگذاری دو کار مهم انجام می‌دهد. اول اینکه چون دارای گلیسرول است، نمونه‌های DNAرا سنگین‌تر از تامپون الکترود (۱X)TBE نموده و باعث می‌شود نمونه‌های DNA در ته چاهک‌ها قرار گیرند. دوم اینکه به دلیل رنگی بودن محلول فوق، امکان ردیابی DNA در جریان الکتروفورز وجود دارد.
دستگاه الکتروفورز به دستگاه تأمین نیروی برق متصل و الکتروفورز با ولتاژ ثابت ۸۵ ولت انجام شد. نمونه‌ها به مدت ۴۵ تا ۵۵ دقیقه داخل ژل آگارز موجود در تانک حرکت کردند (برای حرکت نمونه‌ها از قطب منفی به قطب مثبت می‌باشد). سپس ژل از تانک الکتروفورز برداشته و به مدت ۵ دقیقه داخل محلول اتیدیوم بروماید قرار گرفت. برای مشاهده باندها و تعیین کیفیت DNA، ژل به دستگاه مستندسازی ژل منتقل شده و از آن عکس تهیه شد.

۳-۳-۴-۲- تعیین کمیت و کیفیت DNA با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتری
ابتدا در کوت دستگاه اسپکتروفوتومتر آب دو بار تقطیر شده استریل (حلال نمونه‌هایDNA استخراجی) ریخته شد و دستگاه در طول موج‌های ۲۶۰ و ۲۸۰ نانومتر کالیبره شد. سپس حجم مشخصی از DNA بسته به ضریب رقت، با حجم مشخصی آب دوبار تقطیر شده استریل رقیق و درون کوت ریخته شد. شدت نور در طول موج‌های ۲۶۰ و ۲۸۰ نانومتر اندازه‌گیری شد و در نهایت غلظت DNA، میزان آلودگی پروتئینی و میزان خلوص DNA برآورد شد.
به طور کلی برای اندازه‌گیری غلظت DNA دو رشته‌ای از فرمول زیر استفاده می‌شود.
معادله ۳-۱:
مقدار جذب نور در nm260 × ۵۰ × ضریب رقت = غلظت DNA (میکروگرم در میلی‌لیتر)
با توجه به نسبت جذب نور در طول موج‌های ۲۶۰ و ۲۸۰ نانومتر، می‌توان کیفیتDNA و خلوص آن را تخمین زد ((OD260/OD280 چنان‌چه این نسبت بین ۹۵/۱-۸۵/۱ باشد، کیفیت و خلوص DNA در بهترین حالت است. آلودگی‌های پروتئینی باعث کاهش این نسبت و

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *