پایان نامه جدید : منابع پایان نامه ارشد درمورد بهینه سازی، کشاورزی و منابع طبیعی، بیوتکنولوژی، منابع طبیعی

شوند.
۳- حدود ۱۵دقیقه بعد اشعه UVرا روشن کرده تا علاوه بر ضدعفونی اتاقک کشت، ظروف، محیط های کشت و سایر وسایل در مجاورت اشعه UV به مدت ۱۵ دقیقه استریل گردند.
نکته۱: هیچ گونه مواد گیاهی یا محیط کشت شده را در معرض اشعه UV نباید قرار داد چون گیاه را از بین می برد.
نکته۲-تشعشات UV خطراتی جدی برای سلامتی به همراه دارد. هرگز نباید با چشم غیر مسلح به UV نگاه کرد. اشعه UV می تواند باعث سوزش پوست بدون سوزش شود، بنابراین هنگام استفاده از UV هرگز نباید دست را در داخل کابین لامینار فلو قرار داد. مشکل دیگر تشکیل ازن می باشد که در نتیجه واکنش فیتوشیمیایی با اکسیژن هوا تشکیل می شود. این گاز منفجر شونده یک عامل اکسیدکننده بسیار قوی و غلظت‌های بالای آن باعث سوزش مجاری تنفسی و چشم‌ها می‌شود. لامپ UV را هرگز نباید در مکان بسته برای مدت طولانی روش گذاشت و هرگز نباید در موقع تابش UV از هیپوکلریت یا سایر ترکیبات حاوی کلرید معدنی استفاده کرد. آزاد شدن گاز کلر خطرات جدی برای سلامتی دارد.
۴- قبل از کار دست‌ها را تا آرنج با آب و صابون شستشو داده و سپس با اتانول ۷۰% ضدعفونی صورت می‌گیرد.
۵- به گونه‌ای باید در اتاقک کشت کار کرد که دست‌ها روی هم‌قرار نگیرند، به عبارتی تمام وسایل مورد نیاز دست راست در سمت راست محل کار و تمام وسایل موردنیاز دست چپ، در سمت چپ محل کار قرار گیرند.
۶- در صورت استفاده از استریل کننده الکتریکی باکتی- سینراتور، ابتدا آن را به مدت ۱۰ دقیقه گرم نموده تا بر اثر گرما حالت سرخی در آن ظاهر شود و سپس وسایل را برحسب ذیل استریل می‌کنیم:

(اسکالپل‌های ظریف و نازک ۶ ثانیه
(پنس‌های ظریف و نازک ۸ ثانیه
(اسکالپل‌های بلند ۸ ثانیه
(پنس‌های سنگین ۱۰ ثانیه
۷- پس از استریل کردن وسایل مقدار خیلی کمی الکل ۷۰% بر روی وسیله اسپری کرده تا سرد و خشک شود، سپس از آن استفاده می‌شود.
۸- اگر مواد گیاهی تصادفا روی میز اتاقک افتاد آلوده فرض کرده و حذف می‌شود.
۹- بعد از اتمام کار اتاقک را خاموش کرده و سطوح داخلی آن را با اتانول ۷۰% اسپری و تمییز می‌شود.

۳-۲-۴ ضد عفونی نمودن وسایل آزمایشگاهی، محیط کشت و مواد گیاهی
یکی از مراحل مهم کشت بافت گیاهی به وجود آوردن محیط عاری از آلودگیهاست. برای این منظور ریز نمونهها و محیطهای کشت با استفاده از تکنیکهای خاصی ضدعفونی شوند. محیطهای کشت غالباً با استفاده از اتوکلاو و ریز نمونههای گیاهی با استفاده از مواد شیمیایی ضدعفونی میگردند که برای این منظور از مواد شیمیایی مختلف با غلظتهای متفاوت و روشهای مختلف ضدعفونی استفاده میکنند.

۳-۲-۴-۱ ضدعفونی اندام گیاه
نمونه‌ها را پس از برداشت از مرکز جهاد دانشگاهی مازندران به آزمایشگاه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی انتقال داده، ۵ دقیقه با آب‌روان شستشو داده تا خاک و گرد و غبار آن از بین برود. در ادامه به مدت ۱۰دقیقه در مایع ظرفشویی قرار داده شدند. سپس به مدت ۵ دقیقه با آب‌روان شستشو داده شده به اتاقک کشت انتقال داده شد. مراحل ضدعفونی نمونه‌ها به شرح زیر بود (شکل۳-۱):
۱- غوطه‌ور کردن در هیپوکلرید سدیم (وایتکس) ۱% به مدت ۱۰ دقیقه
۲- شستشو با توئین ۴ قطره با آب مقطر به مدت۲ دقیقه
۳- غوطه‌ور کردن نمونه‌ها در الکل ۷۰% به مدت یک دقیقه
۴- شستشو با آب مقطر ۶ مرتبه و هر بار ۵/۱دقیقه
۵- ریختن نمونه‌ها بر روی کاغذ صافی سترون و خشک کردن آن‌ها (رنجبر و تاجی،۱۳۸۴)

۳-۲-۵ تهیه ریزنمونه
ریزنمونه‌ها از جوانه‌های جانبی، جوان‌های انتهائی، ساقه، برگ، دمبرگ و ریشه‌ها انتخاب شد. با استفاده از اسکالپل و پنس ریزنمونه‌ها به قطعات ۵/۰ سانتی‌متری در آمده و هم داخل لوله‌های آزمایش ۱۰ و۱۵ سانتی‌متری و هم در پتری دیش‌های سایز۸ (درهر پتری ۵ نمونه) که حاوی محیط کشت پایه۱۳۳ (MS) بود کشت شدند (شکل۳-۲)

درب ظروف کشت با پارافیلم مسدود شده و به انکوباتور با دمای ۲±۲۵ درجه سانتیگراد و شرایط نوری ۱۶ ساعت روشنائی و ۸ ساعت تاریکی برای ریز ازدیادی و تشکیل گیاه کامل انتقال داده شدند (شکل۳-۳).

۳-۲-۶ بهینه سازی محیط کشت
در حقیقت بهینه سازی محیط کشت۱۳۴، برطرف کردن مشکلات گیاه از زمان انتقال به محیط کشت مصنوعی تا مرحله سازگاری می‌باشد.

۳-۲-۷ بررسی نمونه‌های کشت شده
به مدت ۴۵روز تمام کشت‌ها آلوده می‌شودند که در این مدت روش‌های ضدعفونی را تغییر داده تا به بهترین پروتکل ضدعفونی دست پیدا کردیم. پس از گذشت ۱۰ روز از کشت با بهترین پروتکل ضدعفونی، اولین علائم رشد در گیاه مشاهده شد و پس از ۱۵ روز تقریبا ۲۰% از نمونه رشد یافته بودند که این نمونه‌ها دارای ریشه، ساقه، برگ و جوانه بودند. نکته قابل توجه این بود که فقط ریزنمونه‌هائی که از جوانه‌های جانبی و جوانه‌های انتهایی تهیه شده بودند رشد یافتند. تعداد ۴۰ لوله آزمایش ۱۰ سانتی‌متری دارای گیاه کامل فاقد آلودگی بدست آمد و به مدت یک ماه می‌گذاریم تا کاملا رشد نماید و برای اعمال EMS آماده شود.

۳-۲-۸ بازیافت کشت‌های آلوده
هر کشت آلوده را ممکن است با استفاده از روش ساده زیر نجات داد:
۱-ظروف حاوی کشت های آلوده را باز شده و با محلول ۵/۰-۱% هیپوکلریت سدیم پر می‌شود.
۲- بر حسب شدت آلودگی یا حساسیت مواد گیاهی، ۱۰-۵۰ دقیقه صبر می شود.
۱- کشت‌ها را از محلول کلر دار برداشته، قاعده آن‌ها را تمیز کرده و برگ‌های اضافی حذف می‌شود.
۲- ریزنمونه‌ها را با آب استریل شستشو داده و سپس مواد گیاهی تمیز شده به محیط کشت تازه انتقال می یابند.
روش دوم: ریزنمونه‌ها را از یک سری محلول‌های هیپوکلریت سدیم رقیق شده عبور می‌دهند مثل غلظت های ۱% ? ۵/۰% ? ۲۵/۰% ? ۱/۰% وسپس بدون شستشوی نهایی با آب استریل آن‌ها را به محیط کشت جدید انتقال می دهند. در این حالت مقداری کلر همراه ماده گیاهی که نهایتا بر روی محیط کشت استریل قرار می‌گیرد وجود خواهد داشت. این مسئله بالاخص برای کشت‌های شدیدا آلوده مفید است. فقط گیاهان غیر حساس به کلر را می‌توان به این روش تیمار کرد. طی این روش بازیافت کشت‌های آلوده ممکن است اکثر برگ‌ها به طور مطلوبی سفید شوند. این کشت‌ها به زودی بازیابی شده و به طور موفقیت آمیزی رشد خواهند کرد.

۳-۲-۹ تیمارهای مورد استفاده
این آزمایش هم بصورت مزرعه‌ای و هم بصورت آزمایشگاهی (کشت بافتی) مورد بررسی قرار گرفت. در قسمت آزمایشگاهی سرشاخه‌های رشد یافته در محیط MS بدون هورمون را با غلظت‌های ۰/۰% (به عنوان شاهد کشت بافتی)، ۰۵/۰% و ۰۱/۰% و ۰۰۵/۰% EMS و در زمان‌های ۲۴ و۴۸ ساعت تیمار داده شد. در قسمت مزرعه‌ای نیز از همین غلظت‌ها و زمان‌ها استفاده شد.

۳-۲-۹-۱ روش تهیه استوک‌های EMS
ابتدا غلظت‌های مورد نیاز از EMS را به صورت زیر تهیه نمودیم:
غلظت ۰۱/۰ در صد از EMS:
cc 100
cc 01/0
Cc 250
X

EMS ۰/۰۲۵cc=

غلظت ۰۵/۰ در صد از EMS:
cc100
Cc 05/0
Cc 250
X

EMS ۰/۱۲۵cc=

متن کامل در سایت    40y.ir

غلظت ۰۰۵/۰ در صد از EMS:
cc100
Cc 005/0
Cc 250
X

EMS ۰/۰۱۲۵cc=

۳-۲-۹-۲ روش اعمال تیمارهای EMS در گیاه کشت بافتی
نمونه‌های کشت بافت سالم وعاری از آلودگی را جدا کرده و به همراه استوک‌های EMS به داخل اتاقک کشت انتقال داده تا در زیر هور عمل اعمال تیمارهای صورت پذیرد. ابتدا درب لوله‌ها را باز کرده و با پنس استریل شده چند برگ انتهائی (برگ‌های پایین) را فشار داده تا ایجاد خراش نماید و EMS از محل ایجاد این زخم‌ها وارد سیستم گیاه شود. سپس با سرنگ از استوک EMS 05/0% برداشته و داخل لوله آزمایش تا آنجائی که خراش در برگ ایجاد شده ریخته (۴ تکرار برای تیمار ۲۴ ساعت و ۴ تکرار برای تیمار۴۸ ساعت) و به سرعت درب آن‌ها را با پارافیلم بسته و مشخصات تیمارها را برروی لوله‌ها یادداشت می‌نمائیم. برای EMS با غلظت‌های۰۱/۰% و ۰۰۵/۰% نیز بصورت روش قبل عمل می‌شود. در نهایت لوله‌های آزمایش را به انکوباتور انتقال می‌دهیم.

۳-۲-۹-۳ روش اعمال تیمارهای EMS در مزرعه
ابتدا بوته‌هائی را که بصورت مجزا در حال رشد هستند را شناسائی کرده (۵ تا۶ ساقه‌ای) سپس ساقه که مورد آزمایش قرار می‌گیرند را انتخاب کرده و برگ‌های قسمت فوقانی آن را چیده و فقط دو برگ انتهائی را نگاه داشته، میکروتیوپ را داخل زمین فرو کرده، ساقه را داخل آن قرار داده (۴ ساقه را در ۴ میکروتپوپ بصورت جداگانه قرار می‌دهیم) و با سرنگ تیمارهای مشخص شده EMS را داخل میکروتیوپ ریخته و کمی سر میکروتیوپ را خالی گذاشته تا بتوانیم با محیط کشت MS درب آن‌ها را ببندیم (شکل۳-۵). تیمارها را به شرح زیر اعمال می‌نمائیم:
تیمار یک EMS01/0% به مدت ۴۸ ساعت، تیمار دو EMS01/0% به مدت ۲۴ ساعت، تیمار سه EMS 05/0% به مدت ۴۸ ساعت، تیمار چهار EMS 05/0% به مدت ۲۴ ساعت می‌باشد.

۳-۲-۹-۴ روش شستشوی تیمارها
پس از گذشت مدت زمان مورد نظر اقدام به شستشو و تمیز نمودن نمونه‌ها از EMS به صورت زیر نمودیم. نمونه‌های کشت بافتی مورد تیمار را به اتاقک کشت انتقال داده و در زیر هود ابتدا درب آن‌هارا باز کرده و محلول EMS موجود در لوله آزمایش را خارج کرده و چندین مرتبه داخل لوله آزمایش آب مقطر سترون شده ریخته تا کاملا شستشو شود، در ادامه برای جبران کمبود مواد غذائی چند قطر از محیط کشت MS مایع را برروی محیط کشت قبلی ریخته و به سرعت برای جلوگیری از آلودگی درب آن‌ها را با پارافیلم می‌بستیم (شکل۳-۶). برای گیاهانی که در مزرعه نیز مورد تیمار قرار گرفته بودند نیز به صورت زیر عمل شد: ابتدا ساقه‌ها را از داخل میکروتیوپ در آورده و میکروتیوپ‌ها را داخل یک نایلون ریخته و از بین برده می‌شود، سپس با سرنگ با آب مقطر چندین مرتبه قسمت‌هایی از گیاه که در تماس با EMS بودند را شستشو داده تا کاملا تمیز شوند (شکل۳-۷). دور بوته‌های هر تیمار را سنگ چین نموده تا از این به بعد گیاهانی که سبز می‌شوند یا از کنار ساقه‌های قبلی جوانه می‌زنند را شناسائی و مورد بررسی قرار بدهیم (شکل۳-۸).

۳-۳ تهیه مواد گیاهی برای اسانس گیری
پس از گذشت ۲ ماه از اعمال تیمار نمونه ها را برداشته نموده و در سایه خشک گردید و به آزمایشگاه اصلاح نباتات دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری منتقل و درآون نگهداری شد.

۳-۴ آنالیز اجراء اسانس
نظر به اینکه پس از اعمال ماده جهش‌زا اتیل متیل سولفانات احتمال تغییر در میزان و اجزاء اسانس گیاه

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *