پایان نامه ارشد:بررسی نسبت جمعیتی اسپرم‌های واجد کروموزم X‌و Y تحت تأثیر برخی عوامل محیطی در گونه گاو با بهره گرفتن از تکنیک Real-Time PCR

دانشگاه آزاد اسلامی

واحد علوم دارویی

دانشکده علوم و فناوری­های نوین، گروه زیست شناسی

 

پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد ((M
Sc))

گرایش: سلولی و مولکولی

 

عنوان:

بررسی نسبت جمعیتی اسپرم های واجد کروموزم X و Y تحت تأثیر برخی عوامل محیطی در گونه گاو با بهره گرفتن از تکنیک Real-Time PCR

استاد راهنما:

جناب آقای دکتر فرید حیدری

اساتید مشاور:

جناب آقای مهندس احسان هاشمی

سرکار خانم دکتر طاهره ناجی

سال تحصیلی93-1392

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

فهرست مطالب

  عنوان                                                                                                                                 صفحه

چکیده فارسی   

             1 

مقدمه  

            2

فصل اول: کلیات

پیشگفتار

            4

  • آناتومی دستگاه تناسلی دام نر

    5                                                        

  • اسپرماتیک کورد (بند بیضه)

    6

1-1-2-  اسکروتوم(کیسه بیضه)

           6

  • ماهیچه دارتوس

    7

  • تونیکا واژنیالیس

    7

  • بیضه ها

    8

  • اپیدیدیم

       10

  • غدد ضمیمه تناسلی

    12

    • آمپولا

      12

1-1-5-2-  وزیکول سمینال

          12 

1-1-5-3-  پروستات

         13

1-1-5-4-  غدد کوپر

         13

  • آلت تناسلی نر

    14

  • فیزیولوژی دستگاه تناسلی دام نر

             15

1-2-1-  اسپرماتوژنز

          15

1-2-1-1- اسپرماتوسیتوژنز

         15

1-2-1-2- اسپرمیوژنز

         15

1-2-1-3- روند کلی اسپرماتوژنز

         16

1-2-2-  اسپرم

         20

1-2-3- مایع منی

        21

  • نسبت جنسی

    21

1-3-1-  مقدمه

        21 

  • ژنتیک دام نر

    22

  • تفاوت اسپرم های واجد کروموزوم X و Y

    23

  • تعریف نسبت جنسی

    25

  • اهمیت کنترل نسبت جنسی

    26

  • عوامل موثر بر انحراف نسبت جنسی

    27 

1-3-6-1-  عوامل ژنتیکی و فیزیولوژیکی

       27

1-3-6-2عوامل محیطی

       28

  • روش های تعیین نسبت جنسی اسپرم

    28 

  • واکنش زنجیره­ای پلیمراز کیفی( PCR)

        29

  • واکنش زنجیره­ای پلیمرازکمّی((Real-Time PCR

    31

1-5-1-  تعریف واکنش (Real-Time PCR)  

      31

1-5-2مزایای واکنش Real-Time PCR

      31

  • مراحل اصلی واکنش Real-Time PCR

    32

1-5-4- روش­های انجام واکنش Real-Time PCR

      32

1-5-4-1- قالب غیر اختصاصی Nonspecific Format

      32

1-5-4-2- قالب اختصاصی Specific Format

      34

1-5-4-2-1- شناساگرهای دوسویه نشاندار یا شناساگرهای TaqMan

      35

1-5-4-2-2- شناساگرهای بیکون مولکولی

      37

1-5-4-2-3- سیستم شناساگر FRET

      38

1-5-4-2-4- شناساگرهای عقربی

      39

1-5-4-2-5- سایر سیستم­ها

      40

1-5-5- برخی مفاهیم و اصطلاحات در تکنیک Real-Time PCR

      41

1-5-5-1- منحنی تکثیر

      41
1-5-5-2- گزارشگر نرمال­شده((Rn

     43

1-5-5-3- چرخه آستانه( (CT

     44

1-5-5-4- منحنی ذوب

     45

1-5-5-5- منحنی استاندارد

     47

1-5-6- آنالیز داده های کمی

     49

فصل دوم: مروری بر متون گذشته

  • مطالعات پیرامون نسبت جنسی

    51

  • مطالعات روی روش­های تعیین نسبت جنسی

    53  

فصل سوم: مواد و روش­ها

  • زمان و محل انجام تحقیق

    58

  • مراحل انجام کار

    58

3-2-1- تهیه اسپرم

       58

3-2-2- استخراج DNA از سلول­های اسپرم

       59

3-2-2-1- مواد و لوازم استخراج DNA

       59 

3-2-2-2- روش کار برای استخراج DNA

       60

3-2-2-2-1- شستشوی اسپرم

       60

3-2-2-2-1-1- ساخت محلول PBS

       60

3-2-2-2-1-2- شستشو

       61

3-2-2-2-2- پروتئین­زدایی

      62

3-2-2-2-2-1- ساخت محلول Lysis Buffer

      62

3-2-2-2-2-2- رسوب پروتئین­ها

      62  

3-2-2-2-3- جداسازی DNA

      63 

3-2-2-2-4- تعیین غلظت DNA

      64

3-2-2-2-4-1- استفاده از ژل آگارز

      64 

3-2-2-2-4-1-1- مواد و لوازم ساخت ژل آگارز

      64

3-2-2-2-4-1-2- روش کار با ژل آگارز

       65

3-2-2-2-4-2– استفاده از دستگاه اسپکتروفوتومترِ نانودراپ

       66

3-2-3- واکنش PCR کیفی

      66

3-2-3-1- هدف از واکنش PCR کیفی

      66

3-2-3-2- مواد و لوازم برای واکنش PCR کیفی

      66

3-2-3-3- روش انجام واکنش PCR کیفی

      67

3-2-3-3-1-  طراحی آغازگر

      67     

3-2-3-3-2- رقیق­سازی آغازگرها

      68

3-2-3-3-3- محاسبه مقادیر واکنشPCR کیفی

      69

3-2-3-3-4تعیین شرایط واکنشPCR کیفی

      70

3-2-3-3-5- آماده­سازی مخلوط واکنشPCR کیفی

      70

3-2-3-3-6- الکتروفورز محصولات PCR کیفی

      71

3-2-4- واکنش Real-Time PCR

      71

3-2-4-1- – هدف از انجام واکنش Real-Time PCR

      71

3-2-4-2- مواد و لوازم برای واکنش Real-Time PCR

       71

3-2-4-3- روش انجام واکنش Real-Time PCR

       72

3-2-4-3-1- رقیق­سازی آغازگرها

      72

3-2-4-3-2- محاسبه مقادیر در واکنش Real-Time PCR

      73  

3-2-4-3-3- تعیین شرایط دمایی و زمانی واکنش Real-Time PCR

      73

3-2-4-3-4- رسم منحنی استاندارد از طریق واکنش Real-Time PCR

      74

3-2-4-3-5- بررسی CT و TM از طریق واکنش Real-Time PCR

      74

3-2-4-3-6- آماده­سازی مخلوط واکنش Real-Time PCR

      76

3-2-4-3-7- آنالیز داده­های واکنش Real-Time PCR

      76 

فصل چهارم : نتایج

4-1- نتایج استخراج DNA

      78

4-1-1-   نتیجه الکتروفورز محصولات استخراجDNA

      78

4-1-2- نتیجه غلظت­خوانی با دستگاه نانودراپ

      79

4-2- نتیجه الکتروفورز محصولات PCR

     80

4-3- نتایج حاصل از Real-Time PCR

     82 

4-3-1- منحنی استاندارد

        82     

4-3-2- منحنی ذوب و محاسبه TM

        83

4-3-3- منحنی تکثیر و محاسبه CT

          .87

4-3-4- نتیجه الکتروفورز محصولات Real-Time PCR

     
90

4-3-5- آنالیز کمّی داده­ ها

       94    

فصل پنجم : بحث وپیشنهادات

5-1- بحث

     
99     

5-2- پیشنهادات

         102 

منابع  

   103

چکیده انگلیسی 

   106    

ضمایم

  108         

                                                              فهرست جداول

  عنوان                                                                                                                               صفحه

جدول(3-1):شماره ثبت شده دام روی پایوت­های محتوی مایع منی…………………………
………
    58

جدول(3-2): مواد تشکیل دهنده محلول PBS    ………………………………………………………… 60

جدول(3-3): مواد تشکیل دهنده محلول Lysis Buffer …………
……………

…………………   62

جدول(3-4): اطلاعات مربوط به آغازگر­ها ………………………………………………………………

   68

جدول(3-5): مقادیر مواد واکنش PCR    ………………………………………………………………… 69

جدول(3-6): شرایط دمایی و زمانی واکنش PCR ……………………………………………………
    70

جدول(3-7): مقادیر مواد واکنش PCR …………………………………………………………………    73

جدول(3-8): شرایط دمایی و زمانی واکنش PCR Real-Time   ………
……………………
……   74

جدول (4-1):غلظت DNA ( ng
µl-1 ) برای 7 رأس گاو در فصل سرد……
……………………
…    79

جدول (4-2): غلظت DNA ( ng
µl-1 ) برای 7 رأس گاو در فصل گرم……
…………

…………   79

جدول (4-3) : محاسبه میانگین عدد CT بین دو تکرار در هر نمونه………
………

………

   95

جدول (4-6) : عدد مقیاس مطلق(تفاوت عدد الگوی اولیه ژن SRY و PLP …
………

    ………………97

فهرست اشکال

  عنوان                                                                                                                             صفحه

شکل (1-1) : اسپرماتیک کورد(بند بیضه)  ……………………………………………………………      6

شکل (1-2) : اسکروتوم (کیسه بیضه) …………………………………………………………………      7

شکل (1-3) : بیضه ها در گاو …………………………………………………………………………
       8

شکل (1-4) : بیضه ها ولوله های اسپرم ساز و شبکه رته تستیس …………………………………     10

شکل (1-5) : اپیدیدیم …………………………………………………………………………………     11

شکل (1-6) : غدد ضمیمه تناسلی     …………………………………………………………………… 13

شکل (1-7) : آلت تناسلی گاو  نر ……………………………………
………………………………     14

شکل (1-8) : اسپرماتوژنز ………………………………………………………………………………     16

شکل (1-9) : اسپرماتوژنز و هورمون­ها ………………………………………………………………
     17

شکل (1-10) : مراحل سلولی اسپرماتوژنز ……………………………………………………………    19

شکل (1-11) : اسپرم …………………………………………………………………………………
    20

شکل (1-12) : کاریوتیپ گاو …………………………………………………………………………     22

شکل (1-13) : اسپرم واجد کروموزوم Y و X ………………………………………………………    24

شکل( 1-14) : مکانیسم عمل رنگ SYBR-Green طی واکنش زنجیره ای پلیمراز(PCR)……33

شکل( 1-15) : مکانیسم عمل شناساگرهای دوسویه نشاندار یا شناساگرهای TaqMan  ………………
.36

شکل( 1-16) : مکانیسم عمل شناساگرهای بیکون مولکولی طی واکنش زنجیره ای پلیمراز(PCR)……
… 37

شکل( 1-17) : مکانیسم عمل شناساگر FRET طی واکنش زنجیره ای پلیمراز(PCR) ………   38

شکل( 1-18) : مکانیسم عمل شناساگر عقربی طی واکنش زنجیره ای پلیمراز(PCR)…

……… 40

شکل (1-19) : منحنی تکثیر در واکنش Real-Time PCR ………………………………

  42

شکل (1-20) : رنگ مرجع خنثی) (ROX  ………………………………………………………   43

شکل (1-21) : منحنی تکثیر و نمایش CT ………………………………………………………
   44

شکل (1-22) : منحنی ذوب و Tm …………………………………………………………………  46

شکل (1-23) : منحنی استاندارد ……………………………………………………………………
  48

شکل(3-1):پایوت­های محتوی مایع منی ……………………………………………………………  58

شکل (4-1) :  نتایج حاصل از استخراج DNA …………………………………………………

  78

شکل( 4-2 ): نتایج حاصل از PCR ………………………………………………………………

  81

شکل (4-3) : منحنی استاندارد ……………………………………………………………………

  82

شکل( 4-6 ): منحنی ذوب و میزان Tm محاسبه­شده برای آغازگر SRY در فصل گرم ……

  84

شکل( 4-7 ): منحنی ذوب و میزان Tm محاسبه­شده برای آغازگر SRY در فصل سرد  ……
84

شکل( 4-8 ): منحنی ذوب و میزان Tm محاسبه­شده برای آغازگر PLP در فصل گرم ……
  85

شکل( 4-9 ): منحنی ذوب و میزان Tm محاسبه­شده برای آغازگر PLP در فصل سرد ……
  85

شکل( 4-10 ): منحنی ذوب و میزان Tm محاسبه­شده برای آغازگر PARدر فصل گرم……
  86

شکل( 4-11 ): منحنی ذوب و میزان Tm محاسبه­شده برای آغازگر PARدر فصل سرد……
  86

شکل( 4-12 ): منحنی تکثیر و میزان CT مربوطه برای آغازگر SRY در فصل گرم ………….87

شکل( 4-13 ): منحنی تکثیر و میزان CT مربوطه برای آغازگر SRY در فصل سرد…………  87

شکل( 4-14 ): منحنی تکثیر و میزان CT مربوطه برای آغازگر PLP در فصل گرم …………   88

شکل( 4-15 ): منحنی تکثیر و میزان CT مربوطه برای آغازگر PLP در فصل سرد …………  88

شکل( 4-16 ): منحنی تکثیر و میزان CT مربوطه برای آغازگر PAR در فصل گرم…………  89

شکل( 4-17 ): منحنی تکثیر و میزان CT مربوطه برای آغازگر PAR در فصل سرد
………  89

شکل( 4-18 ) : نتیجه واکنش qPCR  برای آغازگر SRY   ………………………………

91

شکل (4 – 19): نتیجه واکنش qPCR  برای آغازگر SRY …………………
………

……… 91

شکل(4-20) : نتیجه واکنش qPCR  برای آغازگر PLP  ………

…………………

………… 92

شکل(4-21) : نتیجه واکنش qPCR  برای آغازگر PLP    …………………………

…………92

شکل(4-22) : نتیجه واکنش qPCR  برای آغازگر  

………………………

…………PAR   93

شکل(4-23) : : نتیجه واکنش qPCR  برای آغازگر
……………………

…………PAR

93

شکل (4-24) : فرمول­های محاسبه و آنالیز کمّی آزمایش  …………………………………

…   96

چکیده فارسی:

جنسیت موالید در صنعت دامپروری و از نظر اقتصادی بسیار حائز اهمیت است
افزایش بهره­وری اقتصادی و نیز کنترل بیماری­های ژنتیکی وابسته به جنس ارتباط مستقیمی با جنسیت موالید دارد
نسبت جنسی موالید اتفاقی نبوده و عوامل مختلفی در تعیین جنسیت موالید نقش دارد
یکی از این عوامل،نسبت جنسیتی اسپرم­های واجد کروموزوم X و Y در انزالِ طبیعی است
مهم ترین عوامل محیطی که احتمال می رود روی این نسبت تاثیر داشته باشد،استرس گرماییو تفاوت های فردی می باشد
در مطالعه حاضر به بررسی تغییر نسبت جمعیتی اسپرم های واجد کروموزوم Y به اسپرم های واجد کروموزومX در انزال گاو نر تحت تاثیر تنش گرمایی و بررسی تفاوت های فردی با بهره گرفتن از تکنیک Real-Time PCR پرداخته شد
به این منظور از 7 رأس گاو نر بالغ در دو فصل گرم (تحت تأثیر استرس گرمایی) و سرد نمونه گیری به عمل آمد و پس از استخراج محتوی ژنتیکی، با بهره گرفتن از سه جفت آغازگر ژن­های SRY (شاخص کروموزوم Y)،PLP (شاخص کروموزوم X ) و PAR (ژن خانه­دار)و با بهره گرفتن از روش Q-PCR مورد ارزیابی کمی قرار گرفتند
نتایج این تحقیق نشان داد که نسبت جمعیتی کروموزوم­های واجد X و Y در انزال طبیعی در میان دام­ها یکسان نیست
همچنین نشان داد که تنش گرمایی با افزایش نسبت جمعیتی کروموزوم­های Y رابطه دارد
کلمات کلیدی: نسبت جنسی، اسپرم، استرس گرمایی، تفاوت فردی، Real-Time PCR

مقدمه

امروزه در جهت توسعه صنعت دامپروری در راستایبهبود اقتصادی، بهبود ژنتیکی و سلامت دام،یکی از بهترین راه­ها کنترل جنس موالید و نسبت جنسی است
یکی از بهترین راه ها برای بررسی نسبت جنسی موالید و کنترل آن تعیین جنسیت اسپرم ها و نسبت آنها است
این نسبت تحت تأثیر عوامل مختلفی از جمله عوامل محیطی و ژنتیکی است
مهم ترین عواملی که ممکن است بر این نسبت تأثیر معنی داری داشته باشد، استرس گرمایی[1] و تفاوت های فردی می باشد

به این منظور مطالعه حاضر به بررسی نسبت جمعیتی اسپرم های واجد کروموزوم Y به اسپرم های واجد کروموزوم X در انزال گاو در دام­های مختلف و تحت تاثیر تنش گرمایی با بهره گرفتن از تکنیک Real-Time PCR می پردازد

در این آزمایش از روش Real-Time PCR با ماده شناساگر SYBR Green و ارزیابی نسبی استفاده شد
به همین جهت 3 آغازگر (Primer) تحت عنوان SRY (شاخصه کروموزوم(YPlP(شاخصه کروموزوم X) و PAR (به عنوان ژن خانه دار[2]) که کنترل داخلی محسوب می شود،طراحی شد

پیشگفتار:

نسبت جنسی موالید یک شاخص سرشماری مهم است که از اواخر قرن هفدهم مورد بررسی قرار گرفته است
اگر بتوانیم این نسبت را کنترل کنیم یا نتایج نسبت جنسی را تغییر دهیم برای اصلاح نژاد دام در صنعت دامپروری و از نظر اقتصادی بسیار مفید خواهد بود
تئوری نسبت جنسی و توضیح علل و مکانیسم های آن هنوز موضوعی قابل بحث است[28 ، 27]

در صنعتپرورش گاو گوشتی تولید گوشت بدون چربی بر پایه تولید گوساله نر می باشد
اما در صنعت گاو شیری تولید گوساله ماده به منظور حفظ گله حائز اهمیت است
بنابراین کنترل نسبت جنسی در حیوانات جایگاه بالایی در برقراری تعادل نسبت به نرها و ماده ها در گونه های در حال انقراض،تسریع روند اصلاح ژنتیکی دام ها،تسهیل مدیریت دامپروری و بهره های فراوان در دامپروری دارد[27, 3]

در پستانداران در جنس ماده دو کروموزومجنسی مشابه (XX) حضور دارد  امادر موجود نر به جهت دارا بودن دو کروموزوم جنسی متفاوت (XY) معین کننده جنس فرزند است[11, 10]

پس اگر بتوانیم عوامل موثر بر تغیر نسبت جنسیت اسپرم ها (حاوی X و یا Y بودن) را بررسی کنیم و این عوامل را کنترل کنیم،در واقع می­توانیم نسبت جنسی را تحت کنترل بگیریم
دیده شده است که عوامل گوناگونی از جمله محیط و وراثت می توانند روی جنسیت اسپرم ها موثر باشند
یعنی اینکه منجر به این امر می شود که نسبت جنسی اسپرم ها در انزال که به طور تئوری 1:1 است اما در عمل اینگونه نیست را دستخوش تغییر کند[31, 27, 8]

بررسی نسبت جمعیتی اسپرم های واجد کروموزوم X به اسپرم های واجد کروموزوم Y  با بهره گرفتن از روش هایی نظیر فلوسیتومتری،PCR، Real-Time PCR و FISH انجام می گیرد[31،25، 17]

بدین منظور در این پایان نامه برآنیم که

اثر دو عامل تنش گرمایی و تفاوت های فردی را روی تغییر نسبت جنسی اسپرم ها از 1:1 به مقداری متفاوت با بهره گرفتن از تکنیک Real-Time PCR بررسی کنیم

پیش بینی ما این است که اولاً در فصل گرما و در تنش گرمایی تعداد اسپرم های واجد کروموزوم Y نسبت به اسپرم های واجد کروموزوم  Xدر انزال گاوها بیشتر است و ثانیاً این نسبت در گاوهای متفاوت با هم فرق دارد(تفاوت فردی)،در این تحقیق بررسی ما بر روی مایع منی 8 گاو است که یک بار در فصل گرما و یک بار در فصل سرما در آن­ها انزال صورت گرفته است،می باشد

تعداد صفحه : 125

قیمت : 14700 تومان

بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود

پشتیبانی سایت :        ****       asa
[email protected]
com

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید

***  *** ***