منابع پایان نامه ارشد درمورد کشاورزی و منابع طبیعی، استان مازندران، منابع طبیعی- خرید متن کامل

دانلود پایان نامه
BA، ۷۴% ریشه رشد یافته و شاخص ساقه در آن ۷۶/۸ سانتیمتر بود و ترکیب هورمونی ۸۴/۸ BA و ۴۲/۱۱ میکرومول در لیتر IAA باعث القاء ۷۰% ریشه و شاخص ساقه ۷/۷ سانتیمتر بوده است.
مفتاحی‌زاده و همکاران (۲۰۱۰) گزارش کردند که اکسین‌های مانند IBA,IAA,NAA باعث تحریک ریشه در بادرنجبویه می‌شود و در غلظت ۱میلی‌گرم در لیتر NAA پس از ۲۵ روز ۹۶% از ریشه تشکیل شده در حالی که IBA در همان زمان و غلظت باعث القاء ۶۴% از ریشه‌ها شد و بطور متوسط طول ریشه ۰۴۵/۰±۳۲/۳ سانتیمتر بدست آمد. متوسط تعداد ساقه در ریزنمونه که در محیط با غلظت ۳میلی‌گرم در لیتر BAP همراه با ۵/۰ میلی‌گرم در لیتر NAA بوده‌اند دارای شاخص ۰۸/۱ بود.
مفتاحی‌زاده و همکاران (۲۰۱۰) لپه‌های جدا شده از نهال ۲۰ روزه را در محیط کشت B5 و MS بدون تنظیم کننده‌های رشد قرار داده اما نتایج مطلوبی را بدست نیاوردند و نمونه‌ها جوانه‌ای ندادند. محیط کشت MS حاوی ۳میلی‌گرم در لیتر به همراه ۱-۲ میلی‌گرم در لیتر NAA بهترین ترکیب برای شروع رشد ریزنمونه های نوک ساقه است (مفتاحی‌زاده و همکاران،۲۰۱۰).
مرادخانی (۲۰۱۲) گزارش کرد که جدا کشت بدون تنظیم کننده رشد گیاه بادرنجبویه توانایی تولید کالوس و ساقه رشد یافته را ندارد. همچنین به این نتیجه رسید که ترکیب‌های مختلف BAوNAA موثرترین ترکیب برای ریزنمونه‌ها و تعداد جوانه‌های رشد یافته (۷۴%) با ۳/۱۲ جوانه برای هر ریزنمونه بوده است. غلظت‌های بالای اکسین و سیتوکنین مانع رشد و احیاء جوانه‌ها بوده و غلظت‌های بالای BA باعث کاهش تعداد جوانه ها در کالوس می‌شوند.

فصل سوم
مواد و روش‌ها

۳-۱ مواد گیاهی
این تحقیق درآزمایشگاه اصلاح نباتات دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری از آذرماه ۹۱ لغایت تیرماه ۹۲ انجام شد. گیاه بادرنجبویه (Melissa officinalis) از مرکز جهاد دانشگاهی استان مازندران تهیه و پس از شناسایی جنس و گونه و تائید نام علمی توسط کارشناسان جهت اخذ ریز نمونه، به آزمایشگاه انتقال داده شد.

۳-۲ کشت بافت
انتخاب گیاه، استقرار در محیط کشت، جلوگیری از آلودگی، سازگاری با محیط کشت و… مراحل اصلی در کشت بافت می‌باشد که بایستی برای هرگونه از گیاهان بهینه‌سازی شود.
بافت‌ها و اندام‌های گیاهی در شرایط in vitro بر‌روی محیط‌های مصنوعی که با استفاده از مواد‌ غذائی مورد نیاز برای رشد تهیه می‌شوند، رشد می‌کنند. موفقیت کشت بافت گیاهی بشدت تحت تاثیر مواد مورد استفاده در محیط کشت است. بنابراین، در اولین گام باید به ساخت محلول‌های ذخیره و در نهایت محیط کشت مصنوعی پرداخت (گانگ و همکاران۱۳۰، ۲۰۰۱؛ فروتن و وادی دار،۱۳۸۵).

۳-۲-۱ تهیه محلول ذخیره محیط‌های کشت
در این تحقیق از محیط کشت موراشیک و اسکوگ (MS) (جدول ۳-۱) به منظور کشت اندام‌های مختلف گیاه بادرنجبویه، باززائی مستقیم و ریشه‌زائی استفاده شد. برای آماده‌ سازی محیط کشت، تهیه محلول ذخیره لازم است. محلول‌های ذخیره ماکرو، میکرو، ویتامین‌ها و محلول ذخیره آهن- سدیم به طور جداگانه تهیه شده و در یخچال در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد نگهداری گردیدند (گانگ و همکاران، ۲۰۰۱). طرز تهیه محلول‌های محیط کشت در زیر شرح داده شده است.

۳-۲-۱-۱ تهیه محلول ذخیره ماکرو
محلول ماکرو به صورت ×۱۰ تهیه گردید، بدین صورت که میزان ۱۰ برابر غلظت نهائی هر کدام از مواد ماکرو را وزن کرده و در یک لیتر آب مقطر حل کرده و برای تهیه یک لیتر محیط کشت یک دهم محلول یعنی ۱۰۰میلی‌گرم استفاده می‌شود. به عنوان مثال غلظت نهائی KH2PO4 با غلظت mg/l 170، برای تهیه محلول ×۱۰ باید gr7/1 را با ترازوهای دیجیتالی وزن کرده و در داخل آب مقطر حل کنیم.(جدول۳-۲)

۳-۲-۱-۲ تهیه محلول ذخیره عناصر میکرو
محلول ذخیره عناصر میکرو به صورت ×۱۰۰ تهیه می‌شود. بدین منظور مقادیر ذکر شده در جدول (۳-۳) را برحسب گرم در لیتر محاسبه کرده و عدد حاصله را در ۱۰۰ ضرب می‌شود. عناصر میکرو را به صورت ×۱۰۰ وزن و در آب حل کرده و در مرحله بعد حجم محلول را با آب مقطر به یک لیتر می‌رسانیم. چون این محلول ذخیره به شکل ×۱۰۰ می‌باشد برای تهیه یک لیتر محیط کشت میزان ۰۱/۰ آن یعنی ۱۰ میلی‌لیتر را استفاده می‌نمائیم (گانگ و همکاران، ۲۰۰۱).

جدول ۳-۱ محلول عناصر کم مصرف MS با غلظت ×۱۰۰
غلظت نهایی در محیط کشت (
) mg/l (
غلظت در یک لیتر محلول ذخیره ) mg/l (
نام ماده
۳/۲۲
۲۲۳۰
MnSO4.4H2O
۲/۶
۶۲۰
H3BO3
۲۵/۰
۲۵
Na2MoO4.2H2O
۶/۸
۸۶۰
ZNSO4.7H2O
۸۳/۰
۸۳
KI
۰۲۵/۰
۵/۲
CoCl2.6H2O
۰۲۵/۰
۵/۲
CuSO4.5H2O

جدول۳-۲ ترکیبات محیط کشت پایه (MS)

عناصر ماکرو

عناصر میکرو

آهن-سدیم

ویتامین
نام ماده غلظت نهائی برحسب/l gr
KNO3 ۱۹
NH4NO3 ۵/۱۶
CaCL2.2H2O ۴/۴
MgSO4.7H2O ۷/۳
KH2PO4 ۷/۱

H3BO3 ۶۲/۰
ZnSO4.7H2O ۸۶/۰
MnSO4.4H2O ۲۳/۲
Na2MoO4 ۰۲۵/۰
CoCL2.6H2O ۰۰۲۵/۰

CuSO4.5H2O ۰۰۲۵/۰
KI ۰۸۳/۰

FeSO4.7H2O ۷۸/۲
NaEDTA.2H2O ۷۲/۳

Thaiamin ۱/۰
Pyridoxin-HCL ۰۵/۰
Nicotinic acid ۰۵/۰
Glycin ۲/۰

میواینوسیتول ۱/۰
ساکاروز ۳۰
آگار ۷

۳-۳جدول عناصر پرمصرفMS با غلظت×۱۰
غلظت نهایی در محیط کشت (mgl-1)
غلظت در یک لیتر محلول ذخیره (mgl-1)
نام ماده
۱۶۵۰
۱۶۵۰۰
NH4NO3
۱۹۰۰
۱۹۰۰۰
KNO3
۱۷۰
۱۷۰۰
KH2PO4
۳۷۰
۳۷۰۰
MgO4.7H2O
۴۴۰
۴۴۰۰
CaCl2.2H2O

۳-۲-۱-۳ تهیه محلول ذخیره آهن-سدیم
برای تهیه این محلول با غلظت ×۱۰۰ ، مقدار ۷۸/۲ گرم از سولفات آهن (FeSO4.7H2O) را وزن کرده و آن را در ۳۵۰ میلی‌لیتر آب مقطر که دمای آن نزدیک به نقطه جوش است حل کرده و با همزن کاملا به هم می‌زنیم. همچنین مقدار ۷۲/۳ گرم از سدیم اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (NaEDTA.2H2O) را وزن کرده و در ۳۵۰ میلی‌لیترآب مقطر حل کرده و به هم می‌زنیم. سپس این دو محبوب را با هم مخلوط کرده و میزان ۳۰۰ میلی‌لیتر دیگر آب مقطر اضافه نموده و در حین حرارت دادن به آرامی توسط همزن مغناطیسی به هم زده می‌شود (گورگی و همکاران۱۳۱، ۲۰۰۸).(جدول۳-۴).

۳-۲-۱-۴ تهیه محلول ذخیره ویتامین‌ها
محلول ذخیره ویتامین‌ها و اسیدهای آمینه به صورت ×۱۰۰ تهیه شد. همانند محلول ذخیره عناصر میکرو مقادیر لازم این ویتامین‌ها طبق جدول ۳-۴ برحسب گرم محاسبه و در ۱۰۰ ضرب شده و مقادیر حاصله در ۵۰۰ میلی‌لیتر آب مقطر حل می‌گردد.

جدول ۳-۴ محلول ذخیره آهن، ویتامین و اسیدهای آمینه با غلظت×۱۰۰
غلظت نهایی در محیط‌کشت(mgl-1)
غلظت در یک لیتر محلول ذخیره(mgl-1)
نام ماده
۱
۱۰۰
Thaiamin
۵/۰
۵۰
Pyridoxine-HCL
۵/۰
۵۰
Nicotinic acid
۲
۲۰۰
Glycin
۸۵/۲۷
۲۸۷۰
FeSO4.7H2O
۲۵/۳۷
۳۷۲۰
Na2EDTA

نکته: بهترین محل نگهداری محلول‌های ذخیره، یخچال است که در آنجا به مدت چندین ماه قابل نگهداری هستند. همیشه تهیه محلول‌های ذخیره با آب مقطر یا آب غیرمعدنی صورت می‌گیرد و نام‌ و تاریخ تهیه بطور واضح روی آن ثبت می‌گردد. برای تهیه محلول‌های ذخیره بایستی همیشه از مواد شیمیائی معتبر و با درجه خلوص بالا استفاده کرد. جهت کاهش تعداد محلول‌های ذخیره می‌توان چندین نمک را با هم مخلوط کرد. در مخلوط کردن نمک‌ها بایستی به عواملی نظیر ثبات محلول و رسوب‌دهی آن توجه نمود. محلول ذخیره نیترات معمولا رسوب می‌کند و باید قبل از استفاده گرم شود تا کریستال‌ها کاملا حل گردد. هر محلول ذخیره‌ای که بنظر می‌رسد کدر شده و یا رسوب داده، باید حذف شود.

۳-۲-۲ تهیه محیط کشت
جهت تهیه ۱۰۰۰ سی‌سی محیط کشت، در یک ارلن ۱۰۰۰میلی‌لیتری، ۱۰۰سی‌سی از استوک ماکرو، ۱۰ سی‌سی از استوک میکرو، ۱۰ سی‌سی از استوک ویتامین، ۱۰ سی‌سی از استوک آهن، میواینوسیتول ۱/۰ گرم و ۳۰ گرم ساکاروز می‌ریزیم و سپس به میزان ۵۰۰ سی‌سی آب مقطر به آن اضافه می‌کنیم. آنگاه ارلن را بر روی همزن مغناطیسی قرار داده تا ساکاروز حل شود. سپس به حجم ۱۰۰۰ سی‌سی رسانده شد و pH محیط روی ۷/۵ تنظیم گردید (محدوده بهترین pH بین ۶/۵ تا۸/۵ می‌باشد) (باقری، ۱۳۸۶). برای تنظیم pH از اسیدکلریدریک (HCL) یک نرمال و سود (NaOH) یک نرمال استفاده می‌شود (زمانی که pH محیط بالاتر از حد استاندارد بود از HCL و زمانی که پائین تر از از حد استاندارد بود از NaOH استفاده شد). بعد از اندازه گیری pH، آگار به میزان ۷ گرم اضافه شد و درب ظرف را با فویل آلومینیومی پوشانده و جهت استریل شدن به اتوکلاو منتقل شد. اتوکلاو را در دمای ۱۲۱ درجه سانتیگراد به مدت ۱۵ دقیقه و فشار یک بار سترون می‌کنیم. پس از پایان زمان استریل، ارلن از اتوکلاو خارج شده و زمانی که دمای محیط کشت به حدود ۴۰ تا ۵۰ درجه سانتیگراد رسید، ارلن حاوی محیط کشت به اتاقک استریل منتقل و در آنجا محیط کشت به درون ظرف پتری سایز ۸ یا لوله‌های آزمایش ۱۰ و ۱۵ سانتی‌متری (در هر پتری ۱۵ سی‌سی، لوله آزمایش ۱۰ سانتی‌متری ۵/۳ سی‌سی و لوله آزمایش ۱۵ سانتی‌متری ۶ سی‌سی) ریخته شد و پس از انعقاد محیط کشت، دور ظروف با پارافیلم۱۳۲ بسته و در زیر هود نگهداری گردیدند.

۳-۲-۳ کار در اتاقک کشت بافت
۱- نیم ساعت قبل از کار قسمت داخلی اتاقک قبل از روشن کردن آن با الکل ۷۰% اسپری و تمیز می شود (این مهم است که از الکل ۷۰% استفاده شود. الکل ۹۵% یا الکل مطلق می تواند باکتری ها یا اسپور قارچ ها را بدون اینکه آن ها را بکشد حفظ نماید).
۲- اتاقک تمیز را روشن شده و تمام ظروف، محیط های کشت نشده و سایر وسایل مورد نیاز استریل شده قبل از قرار دادن در اتاقک تمییز با اتانول ۷۰% اسپری می

دیدگاهتان را بنویسید